二抗用于多種免疫測定中以檢測一抗的存在。這些抗體與酶、生物分子或熒光染料綴合，以允許檢測一抗。與一抗不同，二抗針對一抗的物種和同種型而產(chǎn)生，并用于通過在多個位置結(jié)合一抗來檢測一抗。

要成功選擇二抗，您應(yīng)該考慮以下因素：

確保良好匹配– 宿主物種是產(chǎn)生二抗的動物，應(yīng)始終與一抗宿主不同。例如，如果您使用在兔中產(chǎn)生的一抗，則需要在兔以外的不同物種（如山羊、驢或小鼠）中產(chǎn)生的抗兔二抗（圖 1）。

圖 1：二抗機(jī)制。

整個抗體還是片段？– 實(shí)際上，真正的問題是“您的一抗是單克隆抗體還是多克隆抗體？" 這兩個問題的答案通常取決于應(yīng)用程序。單克隆一抗含有單一同種型的免疫球蛋白。因此，使用特異性識別該同種型的二抗至關(guān)重要。此外，單克隆抗體通常在小鼠、兔和大鼠中培養(yǎng)。因此，如果一抗是小鼠 IgG1，您將需要抗小鼠 IgG 或特異性較低的 F(ab) 片段抗小鼠 IgG。抗體片段很適合免疫組織化學(xué)和免疫熒光，因?yàn)樗鼈兂叽巛^小且能夠穿透組織。然而，較小的尺寸可能會限制與片段綴合的染料或酶的選擇，導(dǎo)致二抗的靈敏度可能低于全抗體選擇。

多克隆一抗含有多種免疫球蛋白 G 同種型的混合物。因此，為了最大限度地檢測靶標(biāo)，最好使用可識別所有同種型的二抗。多克隆通常在兔、山羊、綿羊和驢中飼養(yǎng)，并以全抗體形式（重鏈 + 輕鏈），因此必須用來自不同物種的 IgG 庫對第二宿主物種進(jìn)行免疫，從而使純化的第二抗體能夠識別所有形式。例如，如果多克隆一抗是山羊 IgG，您將需要抗山羊 IgG (H+L)。然而，完整抗體可能會導(dǎo)致高背景和較低特異性，因?yàn)檩p鏈由所有免疫球蛋白共享，這會增加交叉反應(yīng)性（圖2）。

圖 2：免疫測定中完整 IgG 二抗與片段二抗的結(jié)合機(jī)制。

根據(jù)您的應(yīng)用選擇結(jié)合物- 這取決于二抗如何檢測信號。例如，免疫組織化學(xué)、ELISA 和蛋白質(zhì)印跡應(yīng)用使用基于生物素標(biāo)記的比色和化學(xué)發(fā)光檢測來放大信號并提高靈敏度，以及與辣根過氧化物酶 (HRP) 或堿性磷酸酶 (AP) 作用的酶反應(yīng)。然而，對于免疫標(biāo)記、熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)，信號是使用熒光染料（例如 Alexa Fluor）檢測的，這些染料直接與抗體綴合以放大信號和靈敏度。

親和純化與交叉吸附抗體——此步驟用于增加抗體的特異性，可以區(qū)分親和純化和交叉吸附。大多數(shù)二抗都是通過親和層析純化的，從而產(chǎn)生高親和力抗體。此類抗體通常用于 IHC，因?yàn)樗鼈兲峁┳钚〉姆翘禺愋越Y(jié)合，以及用于檢測低豐度蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)印跡。交叉吸附的二抗通常要經(jīng)過額外的純化步驟，以濾除與非目標(biāo)免疫球蛋白種類結(jié)合的成員。此步驟增加了它們的特異性并減少了非特異性背景。這些抗體專為免疫組織化學(xué)等特定應(yīng)用而設(shè)計(jì)。