今天將為大家介紹的是手工細(xì)胞計(jì)數(shù)法。因?yàn)樵诩?xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中，細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)是一項(xiàng)基本功，對于標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)條件以及需要精確定量的實(shí)驗(yàn)來說都非常關(guān)鍵。

下面即是手工細(xì)胞計(jì)數(shù)的基本流程、原理和意義：

1.計(jì)數(shù)前首先準(zhǔn)備好細(xì)胞計(jì)數(shù)器（血球計(jì)數(shù)板）：

使用70%乙醇將蓋玻片和細(xì)胞計(jì)數(shù)板清潔、晾干備用。
將晾干的蓋玻片輕輕覆蓋至血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上。

（注：使用前須保證蓋玻片和計(jì)數(shù)板已充分晾干，否則將影響后續(xù)細(xì)胞充池及計(jì)數(shù)結(jié)果。）

2.制備細(xì)胞懸液：

對于貼壁生長的細(xì)胞，我們需要首先使用胰酶消化的方法使細(xì)胞從培養(yǎng)皿表面脫落。（懸浮細(xì)胞則無需消化，稀釋到合適倍數(shù)即可。）

然后加入適當(dāng)?shù)暮迮囵B(yǎng)基，中和胰酶的作用并重懸細(xì)胞，以得到均質(zhì)的細(xì)胞懸液。要求盡可能將細(xì)胞吹散，不要?dú)埩羧魏渭?xì)胞團(tuán)，但不可用力過大。

（注：消化太過或消化不全均會使計(jì)數(shù)結(jié)果產(chǎn)生偏差。）

臺盼蘭染色（可選）：
如果需要計(jì)算細(xì)胞的活率，則需要將細(xì)胞懸液和0.4%臺盼蘭等體積混合；

室溫孵育3-5分鐘（懸浮細(xì)胞染色時(shí)間可視情況適當(dāng)延長），使臺盼蘭全部進(jìn)入死細(xì)胞，使死細(xì)胞著藍(lán)色。

3.充池：即血細(xì)胞計(jì)數(shù)器加樣

使用吸管或移液器將細(xì)胞懸液或細(xì)胞/臺盼蘭混合液滴加到計(jì)數(shù)池的邊緣。此時(shí)液滴將在虹吸的作用下進(jìn)入蓋玻片下方的計(jì)數(shù)池，此即為充池。

（注：若需進(jìn)行多個(gè)樣品的計(jì)數(shù)，應(yīng)盡量保證每次充池的體積一致，一般在10μl/池左右。）

以同樣的方式在另一側(cè)的計(jì)數(shù)池中也加入計(jì)數(shù)樣品。

將計(jì)數(shù)板靜置幾分鐘使細(xì)胞擴(kuò)散、沉降。

4. 細(xì)胞計(jì)數(shù)：

在100倍顯微鏡下，移動計(jì)數(shù)板將視野對準(zhǔn)計(jì)數(shù)板的中央大方塊，該方塊四周有一圈3條平行線包圍，中間有密集的網(wǎng)格。中央方塊區(qū)差不多剛好可以填滿整個(gè)視野（圖1中標(biāo)記的3號位置）。

                     圖1.細(xì)胞計(jì)數(shù)板圖解

分別計(jì)數(shù)大方格1.2.4.5中的細(xì)胞數(shù)。（為降低計(jì)數(shù)誤差，最好將細(xì)胞濃度調(diào)整為20-50個(gè)/大方格。）并重復(fù)記錄另一側(cè)計(jì)數(shù)池中的細(xì)胞數(shù)，總計(jì)8個(gè)大方塊，然后取均值。

計(jì)數(shù)原則為：“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右"。（判斷標(biāo)準(zhǔn)為是否接觸三條邊線的中間線，如圖2所示）。

                                      圖2. 細(xì)胞計(jì)數(shù)原則

如果有多個(gè)細(xì)胞沒有吹散而成團(tuán)存在，此時(shí)只可記為一個(gè)細(xì)胞。如果團(tuán)塊很多，則需重新吹打甚至重新取樣消化直至絕大多數(shù)細(xì)胞為單個(gè)細(xì)胞。

5. 細(xì)胞濃度計(jì)算：

                                             圖3. 樣品充池體積圖解

由圖3可以得出，每個(gè)大方格的容積為：

1 mm2×0.1 mm = 0.1 mm3 =10-4 cm3= 10-4 ml
即每個(gè)大方格的容積為萬分之一毫升，因此在計(jì)算每毫升液體中的細(xì)胞數(shù)時(shí)需乘以104。

在常規(guī)沒有使用臺盼蘭染色時(shí)，可以以下面公式計(jì)算每毫升樣品中細(xì)胞的個(gè)數(shù)：
每毫升樣品中細(xì)胞的個(gè)數(shù) = 每個(gè)大方格內(nèi)細(xì)胞的平均數(shù) × 細(xì)胞稀釋倍數(shù)×104

如果使用了臺盼蘭染色，還需要計(jì)算活細(xì)胞的百分率：
活細(xì)胞百分率（%）= 臺盼蘭拒染細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100

此時(shí)活細(xì)胞數(shù)的計(jì)算公式為：
每毫升樣品中活細(xì)胞的個(gè)數(shù) = 每個(gè)大方格中細(xì)胞的平均數(shù)×活細(xì)胞比率×細(xì)胞稀釋倍數(shù)×2×104
注：乘2是由于在臺盼蘭染色時(shí)，進(jìn)行了等體積混合，相當(dāng)于稀釋了一倍。

看了以上步驟和原理，大家不禁會問：我們?yōu)槭裁匆獢?shù)細(xì)胞啊？細(xì)胞計(jì)數(shù)究竟有什么意義呢？其實(shí)，當(dāng)我們想了解細(xì)胞的生長情況時(shí)，除了直接觀察細(xì)胞形態(tài)以外，繪制細(xì)胞生長曲線、計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間應(yīng)該就是廣泛采用的評價(jià)指標(biāo)了。

所以盡管使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板手工計(jì)數(shù)細(xì)胞過程十分繁瑣，對實(shí)驗(yàn)者操作者的要求也比較嚴(yán)格，現(xiàn)在也已有很多自動化的細(xì)胞計(jì)數(shù)器/儀，但對于科學(xué)研究中遇到的各種細(xì)胞而言，手工計(jì)數(shù)仍然是易行的方法而被廣大實(shí)驗(yàn)室采用。

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